GENETIKA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).
Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C befrungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni.
DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.
DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). Hal ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA.
Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/ µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan E. coli. Tingkat kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dibadi nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. Kemurnian DNA plasmid kelompok 8 menunjukan hasil sebesar 1,115. Nilai ini belim termasuk nilai DNA murni karena isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1,8.


(sumber : situsbiologiindonesia.blogspot.com)
Suatu kromosom terdiri dari beberapa bagian yaitu kromatid, kromomer, sentromer atau kinetokor, satelit, dan telomer.
1. Kromatid
Kromatid adalah salah satu dari dua lengan hasil replikasi kromosom. Kromatid masih melekat satu sama lain pada bagian sentromer. Istilah lain untuk kromatid adalah kromonema. Kromonema merupakan filamen yang sangat tipis yang terlihat selama tahap profase (dan kadang-kadang pada tahap interfase). Kromonema sebenarnya merupakan istilah untuk tahap awal pemintalan kromatid. Jadi, kromonema dan kromatid merupakan dua istilah untuk struktur yang sama.
2. Kromomer
Kromomer adalah penebalan-penebalan pada kromonema. Kromomer ini merupakan struktur berbentuk manik-manik yang merupakan akumulasi dari materi kromatin yang terkadang terlihat saat interfase. Kromomer sangat jelas terlihat pada kromosom politen (kromosom dengan DNA yang telah direplikasi berulang kali tanpa adanya pemisahan dan terletak berdampingan sehingga bentuk kromosom seperti kawat)
3. Sentromer
Sentromer adalah daerah konstriksi (lekukan primer) di sekitar pertengahan kromosom. Pada sentromer terdapat kinetokor. Kinetokor adalah bagian kromosom yang yang merupakan tempat perlekatan benang spindel selama pembelahan inti dan merupakan tempat melekatnya kromosom.
4. Lekukan kedua
Pada beberapa kromosom terdapat lekukan kedua yang berada di sepanjang lengan dan berhubungan nucleolus. Oleh karena itu disebut dengan NOR (Nucleolar Organizing Regions).
5. Satelit
Satelit adalah bagian kromosom yang berbentuk bulatan dan terletak di ujung lengan kromatid. Satelit terbentuk karena adanya kontriksi sekunder di daerah tersebut. Tidak semua kromosom memiliki satelit.

6. Telomer
Telomer merupakan istilah yang menunjukkan daerah terujung pada kromosom. Telomer berfungsi untuk menjaga stabilitas bagian terujung kromosom agar DNA di daerah tersebut tidak terurai. Karena pentingnya telomer, sel yang telomer kromosomnya mengalami kerusakan umumnya segera mati.

Gb. Struktur kromosom

Gb. Kromomer dan Kromonema suatu kromosom
(sumber : situsbiologiindonesia.blogspot.com)
Letak sentromer pada kromosom membedakan jenis kromosom. Berdasarkan letak sentromer, kromosom dibedakan menjadi:
1. Telosentrik : sentromer terletak di ujung kromosom sehingga kromosom hanya memiliki sebuah lengan dan berbentuk seperti huruf I. Kromosom manusia tidak ada yang berbentuk telosentrik.
2. Akrosentrik : sentromer terletak di dekat ujung kromosom. Satu lengan kromosom sangat panjang, sedangkan lengan lainnya sangat pendek.
3. Submetasentrik : sentromer terletak di submedian (ke arah salah satu ujung kromosom) dan membagi lengan kromosom menjadi dua lengan yang tidak sama panjang. Satu lengan panjang dan satu lengan pendek, seperti huruf L.
4. Metasentrik : sentromer terletak di tengah, membagi lengan kromosom menjadi dua lengan yang hampir sama panjang seperti huruf V.

Gb. Bentuk-bentuk kromosom

Pemurnian DNA

Pemurnian ini dilakukan untuk memisahkan DNA dari Protein, lemak, dan karbohidrat yang berasal dari sel. Pemurnian ini dilakukan dengan alat sentrifus dengan ditambah pelaru-pelerut yang dapat mengendapkan DNA. Untuk DNA kromosom pada praktikum ini digunakan Isopropanol dan untuk mengendapkan DNA plsmid digunakan phenol / kloroform dan amonium asetat dan etanol.

Prinsip dalam melakukan isolasi DNA pada praktikum ini yaitu menggunakan sentrifugasi Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.